麻疹病毒和风疹病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）说明书
【产品名称】
通用名称：麻疹病毒和风疹病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）
【包装规格】10人份/盒，20人份/盒，50人份/盒。
【预期用途】
本品用于定性检测咽拭子样本中麻疹病毒(MV)和风疹病毒(RV)核酸。
麻疹病毒是单股负链RNA病毒，属于副粘病毒科麻疹病毒属。麻疹是一种由麻疹病毒引起的一种急性呼吸道传染病，临床表现为发热、出疹、咳嗽。
风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，为单股正链RNA病毒，风疹是一种由风疹病毒引起的急性发热出疹传染病，临床表现为发热和出疹，包括先天性感染和后天获得性感染。临床上以前驱期短、低热、皮疹和耳后、枕部淋巴结肿大为特征。
麻疹和风疹均是通过呼吸道传染，以急性发热出疹为特征的传染病，常出现流行或爆发，严重危害儿童和青少年的健康。从临床表现上风疹、麻疹与其它发热出疹性疾病难以鉴别。实验室检测方法目前主要有病毒分离、血清学检测、核酸检测等。
【检验原理】
本品采用实时荧光PCR技术，以麻疹病毒和风疹病毒基因组保守区作为扩增靶区域，设计特异性引物和探针进行PCR扩增，在一个反应体系中定性检测样品是否含有麻疹病毒或者风疹病毒核酸。本品含有内标检测系统可监控核酸提取、反转录及PCR扩增过程，避免出现假阴性检测结果。
【主要组成成分】
组份名称 主要成分 规格及数量（单位：支）
10人份/盒 20人份/盒 50人份/盒
反应液A 引物、探针、dNTP、Mg2+、K+。 180μl×1 360μl×1 900μl×1
反应液B 反转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、甘油。 35μl×1 65μl×1 160μl×1
阳性对照 含麻疹病毒和风疹病毒特异性片段的质粒。 20μl×1 50μl×1 100μl×1
阴性对照 经焦碳酸二乙酯处理的纯化水。 500μl×1 500μl×1 500μl×1
【储存条件及有效期】
避光-20±5℃储存，有效期12个月。
反复冻融次数不宜超过10次，开封后-20℃下三个月内用完。生产日期及失效日期见标签。
【适用仪器】
ABI7500、Stratagene Mx3000P、Bio-Rad CFX96荧光PCR仪。
【样本要求】
适用标本类型为咽拭子。
样本采集：将无菌棉拭子稍蘸生理盐水，反复涂抹患者咽部数次，然后将棉拭子浸于1 mL～2 mL标本维持液（含500～1 000单位（Unit，U）/mL青霉素、500 μg/mL～1 000 μg/mL链霉素和2％牛血清DMEM液）或者VTM中，并反复挤压后，弃棉拭子。
样本采集后应及时检测，-20±5℃保存期6个月，-70℃可以长期保存。样本避免反复冻融，如不可避免，反复冻融次数不宜超过5次，采用低温运输。
【检验方法】
1. 样本处理（样本制备区）
用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit（货号：52904）或者本公司的核酸提取试剂盒（货号：HT5025，备案号：粤珠械20140038号）提取RNA，按说明书操作。
2. PCR试剂准备（试剂准备区）
从试剂盒中取出反应液A、反应液B，室温融化后振荡混匀，瞬时离心数秒后使用。
取N个（N=待测样本数+阴性对照+阳性对照）PCR反应管，每管反应液配制如下表：
反应液组份 加量（μl）/人份
反应液A 17
反应液B 3
总体积 20
将各组份充分混合后，瞬时离心数秒。
3. 加样（样本制备区）
向上述对应的反应管中分别加入提取的待测样本RNA、阴性对照和阳性对照各5μl，盖紧管盖，瞬时离心后转移至扩增检测区。
4. PCR扩增检测（扩增检测区）
4.1 将反应管放入荧光PCR仪进行扩增检测。
4.2 循环参数设定（请参照各类仪器的操作说明进行设置）
步骤 温度 时间 循环数（次）
1 逆转录反应 47℃ 30min 1
2 预变性 95℃ 10min 1
3 变性 95℃ 10s 45
4 退火、延伸及收集荧光 56℃ 45s
步骤4中56℃时荧光检测，检测通道：ROX / Texas Red通道为内标，FAM通道为麻疹病毒， HEX/ VIC通道为风疹病毒。
在ABI7500荧光PCR仪中不选ROX校正，淬灭基团选None。
4.3 结果分析
反应结束后需要通过调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值，点击Analysis自动获得分析结果。
【阳性判断值或者参考区间】
采用受试者工作曲线（ROC）确定本试剂盒的麻疹病毒的阳性判断值为Ct＜38；风疹病毒的阳性判断值为Ct＜38。
【检验结果的解释】
质量控制
1. 阴性对照：无典型S型扩增曲线显示；
2. 阳性对照：FAM和HEX检测通道均呈典型S型曲线且Ct值≤30，同时ROX检测通道有
或无扩增曲线；
3. 以上要求需要在同一个实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。
结果判读
1. 阴性结果的判读：
如果FAM、HEX检测通道无扩增曲线或Ct≥40，ROX检测通道有扩增曲线，可判样品为麻疹病毒、风疹病毒阴性；
2. 阳性结果的判读：
如果FAM检测通道有扩增曲线且Ct＜38，ROX检测通道有或无扩增曲线，可判样品为麻疹病毒阳性；
如果HEX检测通道有扩增曲线且Ct＜38，ROX检测通道有或无扩增曲线，可判样品为风疹病毒阳性；
3. 可疑结果的判读：
如果FAM检测通道有扩增曲线且38≤Ct＜40，ROX检测通道有或无扩增曲线，则该样品需要进行复测，如复测结果FAM的Ct值仍然在38~40范围，有明显指数增长期，可判样品为麻疹病毒，否则样品为麻疹病毒阴性。
如果HEX检测通道有扩增曲线且38≤Ct＜40，ROX检测通道有或无扩增曲线，则该样品需要进行复测，如复测结果HEX的Ct值仍然在38~40范围，有明显指数增长期，可判样品为风疹病毒阳性，否则样品为风疹病毒阴性。
【检验方法局限性】
1. 样本收集、处理、运输及保存的失误都可能导致错误的结果；
2. 样本处理时发生交叉污染，可能会出现假阳性结果；
3. 病毒的基因突变也可能导致假阴性结果；
4. 本方法由于引物探针较多，可能形成引物二聚体导致假阳性结果。
【产品性能指标】
1. 最低检测限：麻疹病毒/风疹病毒均为5TCID50/ml。
2. 精密性：批内精密度变异系数≤5%，批间精密度变异系数≤5%，。
3. 特异性：本品与登革病毒、乙型脑炎病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV弓形虫、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒未见交叉反应，与其他病原体反应尚无实验数据。
4. 亚型检测能力：可检出麻疹病毒H1a、A、B3、D8、D9型，风疹病毒2B、1E型，其他型别尚无实验数据。
5. 干扰性试验：常见干扰物质如青霉素、地塞米松、维生素C、扑热息痛、血液、脓液、病毒灵在检验样本中的浓度分别为20μg/ml、0.3μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、25%、25%、200mg/ml时，不会影响到样本检测结果。
6. 本品在临床试验中检测596份咽拭子样本，与参比方法比较：
对于麻疹检测，灵敏度为100%、特异度为95.7%、粗一致性为97.5%。
对于风疹检测，灵敏度为100%，特异度为97.1%，粗一致性为97.6%。
【注意事项】
1. 本品为体外诊断试剂，操作人员应进行专业培训并具备一定的相关经验；
2. 为保证实验结果的准确性和可靠性请使用已校准的移液器，实验用具（一次性PCR反应管、吸嘴、离心管等）需选用去RNA酶处理过的产品；
3. 实验需要严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增检测区），各区物品、工作服均为专用，不得交叉使用，实验后要及时进行清洁；
4. 样品处理必须在生物安全柜中进行，以保护操作人员安全并防止环境污染；
5. RNA样本应保存于-70℃冰箱中，加样前应在室温充分融化、混匀并瞬时离心后使用；
6. 每次实验应设置阴性对照和阳性对照。不同批号的试剂切勿混用，在有效期内使用试剂盒；
7. MV/RV PCR反应液A与MV/RV PCR反应液B混合后，应尽快完成实验，否则随着时间延长而扩增效果变差；
8. 实验过程中佩戴一次性口罩和一次性头套，勤换一次性薄膜手套；
9. 触摸PCR管时切忌戴乳胶手套，防止汗液或乳胶手套上的粉末等影响荧光值检测；
10. 反应液加入模板后应颠倒混匀，轻弹管壁去除气泡，瞬时离心；
11. 使用过的吸嘴应打入盛有10%次氯酸钠的废液缸中，实验结束后与其他废弃物一同集中处理；
12. 扩增完毕后应小心取出PCR管放入密封袋中，严禁在PCR实验室开盖，如果开盖，气溶胶会对PCR室造成污染，实验结果会出现假阳性；
13. 实验结束后应用10%次氯酸钠或75%酒精处理工作台和移液器，然后紫外照射30分钟；
14. 本品涉及的待测样本应视为具传染性物质，避免直接接触身体。样本操作和处理均需符合卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗器械管理条例》相关要求；
15. 本品的内标检测系统仅在风疹病毒、麻疹病毒检测均为阴性时作为对采样及提取效果的评价，当出现风疹病毒、麻疹病毒阳性时，内标出现与否不影响结果的判读。
【标识的解释】
温度限制 体外诊断医疗器械 参考使用说明 不得二次使用
【参考文献】
Mosquera Mdel M，de Ory F，Moreno M，Echevarria JE．Simultaneous detection of measles virus，rubella virus，and parvovirus B19 by using multiplex PCR．J Clin Microbiol，2002，40(1)：111-116．
【基本信息】
注册人/生产企业名称：珠海经济特区海泰生物制药有限公司
住所：珠海市唐家湾镇港湾大道创新四路18号 邮政编码：519085
联系方式：电话号码：0756-3890858 传真号码：0756-3890848
生产地址：珠海市唐家湾镇港湾大道创新四路18号 邮政编码：519085
生产许可证编号：粤食药监械生产许20040941号
【医疗器械注册证书编号/产品技术要求编号】国械注准20183400480
【说明书核准日期及修改日期】2018.11.07
